0

TEKNOLOGI REPRODUKSI DAN INSEMINASI BUATAN : Kriopreservasi Semen Babi

 

TUGAS TERSTRUKTUR

TEKNOLOGI REPRODUKSI DAN INSEMINASI BUATAN

 

Kriopreservasi Semen Babi

 

 

Oleh:

      Fitri Amalia Riska                0911310012

      Hendra Legawata                 0911310014

      Deshinta Rizky P                   0911310037

      Prima Santi                            0911310056

     

 


PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN

PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2011

 

BAB I

PENDAHULUAN

 

1.1    Latar Belakang

Teknologi reproduksi merupakan satu kesatuan dari teknik-teknik rekayasa sistem reproduksi hewan yang dikembangkan melalui suatu proses penelitian dalam bidang reproduksi hewan secara terus menerus dan berkesinambungan dengan hasil berupa alat, metoda ataupun alat dan metoda yang dapat diaplikasikan dengan tujuan tertentu. Terdapat banyak sekali teknologi reproduksi yang bisa diterapkan dalam pelaksanaan kegiatan usaha peternakan yang ditujukan untuk meningkatkan populasi dan produksi. Beberapa diantaranya telah dipakai di Indonesia namun sebagian besar masih merupakan teknologi yang langka yang umumnya dikarenakan biaya perlakuannya dan peralatannya sangat mahal.

Inseminasi Buatan sangat populer pada ternak saat ini. Keberhasilan yang lebih besar daripada kawin alami merupakan salah satu faktor. Pada sapi, kambing, babi, kuda telah dilakukan begitupula pada ayam. Permintaan semen beku dari pejantan unggul menjadi semakin tinggi. Metode pembuatan semen beku berkualitas pada sapi dan kambing menjadi topik di Indonesia. Namun pembuatan semen beku untuk babi jarang sekali dilakukan. Oleh karena itu kami akan mengangkat topik mengenai Kriopreservasi (Penyimpanan) Untuk Babi.

 

1.2    Tujuan

1.2.1    Apa yang dimaksud dengan kriopreservasi dan bagaimana teknik kriopreservasi?

1.2.3    Bagaimana aspek-aspek praktis dari kriopreservasi semen?

1.2.4    Apakah faktor yang mempengaruhi kriopreservasi?

1.2.5    Apakah faktor-faktor yang dapat merusak spermatozoa selama pemyimpanan?

1.2.6    Apakah kelebihan dan kekurangan pada kriopreservasi?

 

1.3    Manfaat

1.3.1        Untuk mengetahui informasi dari teknologi reproduksi yaitu kriopreservasi sperma pada babi

 

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

 

2.1         Kriopreservasi

Secara teoritis, kriopreservasi berasal dari kata krio yang berarti beku, dan preservasi yang berarti penyimpanan pada temperatur rendah. Jadi kriopreservasi adalah teknik penyimpanan materi genetik dalam keadaan beku pada temperatur rendah atau suatu teknik penyimpanan sel hewan, tumbuhan dan materi genetika lainnya (termasuk semen dan oosit) dalam keadaan beku melalui reduksi aktivitas metabolisme tanpa mempengaruhi organel-organel di dalam sel, fungsi fisiologi, biologi, dan morfologi (Suprianata dan Pasaribu, 1992).

Metode kriopreservasi sel spermatozoa dibedakan atas pembekuan lambat (slow freezing), pembekuan cepat (rapid freezing), dan pembekuan sangat cepat (ultra rapid freezing). Prinsip yang terpenting dari kriopreservasi sel spermatozoa ialah pengeluaran air dari dalam sel (dehidrasi) sebelum membeku intraseluler. Bila tidak terjadi dehidrasi akan terbentuk kristal es besar dalam sel yang dapat merusak sel dan bila terjadi dehidrasi yang sangat hebat maka sel akan mengalami kekeringan sehingga sel mati (Supriatna dan Pasaribu 1992). Prinsip perpindahan air keluar masuk membran, baik dehidrasi sebelum deep freezing maupun rehidrasi pada saat pencairan kembali (thawing) menjadi perhatian khusus.

Pada dasarnya tujuan utama kriopreservasi sel spermatozoa ialah melestarikan plasma nutfah yang mendekati kepunahan dan mendukung program teknologi inseminasi buatan (IB) pada ternak. Keuntungan kriopreservasi sel spermatozoa ialah sel spermatozoa dapat disimpan dalam waktu yang tidak terbatas dan dapat digunakan kapan saja bila diperlukan (Toelihere 1985).

 

2.2         Teknik Kriopreservasi

Teknik kriopreservasi dapat dibedakan atas teknik lama (klasik) dan teknik baru :

  1. Teknik lama (klasik)

Teknik ini didasarkan pada freeze-induced dehydration, yaitu dehidrasi yang diinduksi dengan pembekuan pada suhu di bawah titik beku air hingga -40°C. Teknik lama juga disebut teknik pembekuan lambat atau teknik pembekuan dua tahap. Teknik pembekuan dua tahap meliputi inkubasi sel pada krioprotektan dengan total konsentrasi 1-2 M yang menyebabkan dehidrasi moderat dan diikuti oleh pembekuan lambat, misalnya dengan kecepatan 1°C per menit hingga suhu -35°C, lalu pembekuan dalam nitrogen cair dan selanjutnya thawing (pelelehan) (Ika dan Ika, 2003).

  1. Teknik baru

Teknik ini didasarkan pada vitrification, yaitu dehidrasi yang diinduksi pada suhu di atas titik beku air. Vitrification (vitrifikasi) adalah fase transisi air dari bentuk cair menjadi bentuk nonkristalin atau amorf, tembus pandang (glassy) karena elevasi ekstrim dari larutan yang viskos selama pendinginan. Teknik vitrifikasi didasarkan pada dehidrasi sel pada suhu non-freezing (tidak beku), yaitu dengan merendam bahan dalam larutan krioprotektan dengan total konsentrasi 5-8 M pada suhu 0-25°C dan diikuti oleh pembekuan dan selanjutnya pelelehan. Macam-macam teknik baru antara lain (1) vitrifikasi, (2) enkapsulasidehidrasi, (3) enkapsulasi-vitrifikasi, (4) desikasi, (5) pratumbuh, (6) pratumbuh-desikasi, dan (7) dropplet-freezing (Ika dan Ika, 2003).

Adapun penjelasannya sebagai berikut:

  1. Pada teknik vitrifikasi, bahan diperlakukan dengan senyawa krioprotektif dan dehidrasi dengan larutan vitrifikasi, lalu diikuti dengan pembekuan cepat, pelelehan, dan pembuangan krioprotektan serta pemulihan kultur.
  2. Teknik enkapsulasidehidrasi didasarkan pada teknologi yang telah dikembangkan pada produksi benih sintetik. Pada teknik tersebut, bahan dienkapsulasi pada kapsul alginat, lalu ditumbuhkan pada medium yang diperkaya dengan sukrosa dan dikeringkan secara parsial dalam laminar air flow cabinet atau gel silika hingga kandungan air sekitar 20% dan diikuti oleh pembekuan cepat (Ika dan Ika, 2003).
  3. Teknik enkapsulasi-vitrifikasi merupakan kombinasi antara teknik vitrifikasi dan enkapsulasidehidrasi, yaitu bahan dienkapsulasi dengan kapsul alginat, lalu dibekukan dengan teknik vitrifikasi.
  4. Teknik desikasi merupakan teknik yang paling sederhana, yaitu mengeringkan bahan dalam laminar air flow cabinet, gel silika atau flash drying hingga kandungan air 10-20%, kemudian diikuti oleh pembekuan cepat (Ika dan Ika, 2003).
  5. Teknik pratumbuh meliputi penanaman bahan ke dalam media yang mengandung krioprotektan, lalu diikuti oleh pembekuan cepat.
  6. Teknik pratumbuh-desikasi dilakukan dengan menanam bahan ke dalam media yang mengandung krioprotektan, lalu mengeringkannya dalam laminar air flow cabinet atau gel silika dan diikuti oleh pembekuan cepat.
  7. Droplet-freezing diawali dengan pra-perlakuan bahan ke dalam media cair yang mengandung krioprotektan, lalu meletakkan pada Al-foil yang disertai dengan droplet krioprotektan dan diikuti oleh pembekuan cepat (Ika dan Ika, 2003).

Teknik lama memerlukan peralatan terprogram yang cukup mahal harganya, sedangkan teknik baru tidak memerlukan peralatan canggih dan prosedurnya relatif lebih mudah. Teknik lama memerlukan peralatan pembekuan, digunakan pada kultur sel, dan lebih sulit diaplikasikan pada unit sel yang lebih besar seperti tunas apikal atau embrio. Teknik lama berhasil diterapkan pada sistem kultur yang tidak terdiferensiasi (suspensi sel dan kalus) dan spesies yang toleran terhadap suhu dingin, namun tidak berhasil diterapkan pada spesies tropis. Teknik vitrifikasi telah berhasil diterapkan pada spesies dengan skala yang lebih luas (tropis dan subtropis) dan sistem kultur yang lebih kompleks (embriosomatik, suspensi sel, dan meristem apikal) (Ika dan Ika, 2003).

 

2.3         Aspek-Aspek Praktis dari Kriopreservasi Semen

Pemrosesan semen pada kriopreservasi telah dijelaskan sebelumnya. Semen dikemas dalam straw (0,25 dan 0,5 ml) untuk pembekuan dan penyimpanan, atau dibekukan sebagai pelet pada depresi dangkal es kering. Straw dibekukan dalam fase uap diatas nitrogen cair atau pada mesin pembeku dengan laju terkontrol. Spermatozoa dikemas dalam bentuk straw 0,2 ml atau sekitar 10 – 15 juta sel spermatozoa yang diinseminasikan langsung dari straw sesudah pencairan. Sedangkan semen babi dapat dibekukan pada kuantitas yang lebih besar dengan volume 200 µl pada tabung 10 – 15 ml spermatozoa untuk satu kali inseminasi.

Hewan ternak seperti biri-biri, rusa dan hewan ruminansia eksotik lainnya dapat menggunakan pipet khusus inseminasi laparoskopis yang telah dikembangkan dengan ukuran straw 0,25 ml dan jumlah sperma lebih rendah dari metode inseminasi secara trans servikal. Inseminasi dapat dilakukan setelah proses pencairan dalam waktu beberapa detik dengan menggunakan pipet trans servikal. Cara yang lebih mudah untuk mencairkan sampel semen dengan mengurangi konsentrasi simultan krioprotektan yang dapat memberikan keunggulan secara cepat dan jelas setelah proses pencairan basah dengan menuangkan pelet ke dalam larutan khusus. Pencairan straw biasanya dilakukan dengan pencelupan dalam bak air hangat dengan suhu optimum dan kombinasi waktu dapat digunakan dalam penelitan ini dengan pencairan pada suhu maksimum (60-70°C). Teknik pencairan dengan laju penghangatan yang lebih cepat dan dapat menghasilkan kualitas sperma yang baik (Pursel dan Park. 1985). Penyimpanan volume sel lebih besar dapat menyebabkan membran pecah (Bailey et al., 1994). Parkinson dan whitfield (1987) menyatakan bahwa periode pendinginan dan pembekuan dapat mempengaruhi kelangsungan hidup sperma dan meningkatkan fertilitas spermatozoa. Volume pembekuan yang lebih besar seperti maxi-straw atau kantung plastik dapat mempengaruhi kebutuhan dan pengembangan sistem control suhu yang lebih selektif.

 

2.4         Faktor yang Mempengaruhi Kriopreservasi

Sejumlah faktor yang mempengaruhi keberhasilan kriopreservasi dengan teknik pembekuan lambat adalah (1) kecepatan pembekuan, (2) jenis dan konsentrasi krioprotektan, (3) suhu akhir pembekuan, dan (4) tipe dan keadaan fisiologis bahan yang akan disimpan. Jika pembekuan terlalu lambat maka sel terlalu terdehidrasi sehingga konsentrasi zat elektrolit dalam sel menjadi tinggi. Jika pembekuan terlalu cepat maka sel kurang mengalami dehidrasi sehingga terjadi formasi es intraseluler yang bersifat letal.

Penambahan krioprotektan dapat memelihara keutuhan membran dan meningkatkan potensial osmotik media sehingga cairan di dalam sel mengalir keluar dan terjadi dehidrasi. Krioprotekan yang umum digunakan adalah DMSO, gliserol, PEG, sorbitol, dan manitol. Senyawa dalam krioprotektan dapat dipisah menjadi dua, yaitu senyawa yang dapat masuk ke dalam sel (permeating agent) seperti DMSO, gliserol (pada suhu tertentu) dan yang tidak dapat masuk ke dalam sel (non permeating agent) seperti sukrosa dan gula alkohol (manitol, sorbitol) (Ika dan Ika, 2003).

Selama pembekuan dan pelelehan, sel dapat mengalami kerusakan sebagai akibat dari (1) eksposur bahan pada suhu rendah, (2) formasi kristal es, (3) sel terdehidrasi, dan (4) formasi radikal bebas. Eksposur pada suhu rendah dapat menyebabkan inaktivasi protein yang sensitif terhadap suhu dingin. Sebagian besar formasi es intraseluler bersifat letal dan pada dasarnya sel dapat mentolelir formasi es ekstraseluler. Namun demikian, formasi es ekstraseluler juga dapat merusak sel karena daya mekanis dari kristal es yang tumbuh, gaya adesi kristal es terhadap membran, interaksi elektris yang disebabkan oleh perbedaan solubilitas ion pada fase es dan cair, formasi gelembung udara intraseluler, luka khemis yang berhubungan dengan peroksidase lipid dan perubahan pH pada lokasi tertentu (Ika dan Ika, 2003).

Sel yang terdehidrasi terlalu kuat dapat mengalami plasmolisis yang kuat pula sehingga berakibat terhadap perubahan pH, interaksi mikromolekuler, dan peningkatan konsentrasi zat elektrolit. Pada saat pelelehan, kontraksi osmotik dapat menyebabkan endositotik vesikulasi irreversibel yang mengakibatkan sel lisis karena bahan membran yang baru tidak mampu memfasilitasi deplasmolisis (Ika dan Ika, 2003).

 

2.5         Faktor-Faktor yang Dapat Merusak Spermatozoa Selama Pemyimpanan

Kejadian yang dapat merusak dan menurunkan viabilitas spermatozoa selama proses penyimpanan dan pembawa materi genetik ternak (sel gamet) dengan teknik kriopreservasi yaitu kejutan dingin (cold shock) dan pembentukan krista-kristal es. Kejutan dingin terjadi karena adanya penurunan suhu secara mendadak dibawah suhu 0°C. berkaitan erat dengan fase pemisahan dan penurunan sifat-sifat permeabilitas secara selektif dan membran bioligik sel hidup (Watson, 1995).

Pengaruh kejutan dingin terhadap pembawa materi genetik ternak dapat dilihat pada sel spermatozoa dan sel telur (oosit). Pada sel spermatozoa, kejutan dingin menyebabkan terjadi penurunan motilitas, pelepasan enzim pada akrosom, perpindahan ion melewati membran dan penurunan kandungan lipid (fosfolipid dan kolestrol) yang berperan untuk mempertahankan integritas struktural-membran plasma (Weitze dan Petzoidt, 1992; White, 1993).

Pembentukan kristal-kristal es berkaitan erat dengan perubahan tekanan osmotik dalam fraksi yang tidak beku (Watson, 2000). Pengaruh pembentukan kristal-kristal es terhadap pembawa materi genetik ternak selama proses kriopreservasi dapat dilihat pada sel spermatozoa dan sel telur. Pada sel spermatozoa dapat menyebabkan penurunan motilitas dan viabilitas spermatozoa, peningkatan pengeluaran enzim-enzim intraseluler ke ekstraseluler dan kerusakan pada organel-organel sel, seperti mitokondria dan lisosom (Suprianata dan Pasaribu, 1992; Dhani dan Sahni, 1992). Apabila mitokondria rusak dan rantai oksidasi putus akan mengakibatkan spermatozoa berhenti bergerak karena tidak ada pasokan energi dari organel mitokondria. Sumber energi mitokondria berperan untuk menggertak mikrotubul sehingga terjadi pergesekan diantara mikrotubul sehingga spermatozoa dapat bergerak secara bebas (motil).

 

2.6         Kelebihan dan Kekurangan

Setiap teknik penyimpanan mempunyai kelebihan dan kekurangan. Pada penyimpanan in vitro jangka pendek dan jangka menengah diperlukan tindakan subkultur yang berulang-ulang sehingga kurang efisien dalam hal waktu, tenaga, ruangan, dan biaya. Tindakan tersebut juga dapat menyebabkan kultur mengalami kontaminasi dan kehilangan vigoritas dan berpeluang terjadinya perubahan genetik akibat penggunaan zat penghambat tumbuh dalam jangka waktu yang relatif lama (Ika dan Ika, 2003).

Dengan teknik kriopreservasi, kekurangan dari metode penyimpanan in vitro tersebut dapat ditekan seminimal mungkin karena bahan disimpan dalam ruangan bersuhu sangat rendah. Pada suhu yang sangat rendah, sel-sel tidak mempunyai aktivitas metabolik dengan viabilitas yang tetap terpelihara sehingga bahan dapat disimpan dalam jangka waktu yang sangat lama tanpa memerlukan tindakan subkultur yang berulang-ulang. Keuntungan lain dari kriopreservasi sel spermatozoa ialah sel spermatozoa dapat disimpan dalam waktu yang tidak terbatas dan dapat digunakan kapan saja bila diperlukan (Ika dan Ika, 2003).

 

BAB III

REVIEW

 

Pengaruh  kriopreservasi pada kualitas semen dan ekspresi transporter heksosa membran sperma pada spermatozoa babi Iberia

 

Perkembangan teknik kriopreservasi semen dalam beberapa tahun terakhir menjadi perhatian untuk pelestarian materi genetik spesies disebagian Negara. Meskipun penggunaan semen beku untuk inseminasi buatan telah berkembang pesat pada ternak komersial. Hal tersebut belum popular pada babi, dimana semen disimpan dalam bentuk cair masih mendominasi dan 1% semen beku digunakan terutama ekspor inti genetic. Hal tersebut karena jumlah anak babi yang lahir dari inseminasi buatan hampir sama dengan perkawinan alami. Inseminasi buatan dinilai masih mahal walaupun lebih higiene.

Selain itu, spermatozoa babi menderita kerusakan membran dan ekor selama pendinginan dan pencairan, spermatozoa babi hanya bertahan hidup singkat. Sensitivitas dari membran sperma babi hutan untuk pendinginan dipengaruhi oleh karakteristik komposisi lipid pada membran. Komposisi lipid termodifikasi selama pembekuan dan pencairan. Perubahan struktural terjadi karenanya perubahan sumber energi sehingga metabolisme sel dan motilitas sperma. Transfer protein melalui membran sel ikut berpengaruh sehingga mengubah respon terhadap akrosom dan induksi kapasitasi selama pembuahan

Banyak metode yang telah dilakukan untuk mengurangi perubahan sperma selama proses, tetapi hasilnya masih jauh dari optimal. Semen kriopreservasi dari babi Iberia memungkinkan melestarikan variabilitas genetik melalui program bioteknologi reproduksi.  Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan variasi lokalisasi temporal heksosa transporter spesifik (GLUT-3 dan GLUT-5) selama pendinginan dan pencairan spermatozoa babi Iberia dengan perubahan dalam integritas membran plasma dan motilitas (kelangsungan hidup dan keutuhan metabolik).

 

Bahan

Sampel delapan muda berusia 8-10 bulan babi Iberia babi dari breed ‘Entrepelado’ ‘Lampino’ dikumpulkan. Percobaan dilakukan selama 3 bulan, semen dikumpulkan secara manual dua kali seminggu dan dianalisa untuk memastikan kualitas dan homogenitas. Semen dianalisis integritas membrane dan kinetik dengan immunoassay. Semen diperpanjang usianya dengan didinginkan pada 17oC untuk dikirim ke laboratorium.

 

Metode Kriopreservasi Semen

Semen segera diukur motilitas dan morfologi (minimal motilitas progresif 70% dan morfologis 80% )spermatozoa normal yang diproses. Ditambahkan diluter BTS Kemudian disentrifugasi berpendingin pada 17oC selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet sisanya kembali diperpanjang dengan diluter laktosa-kuning telur (80 ml(80% v /v, 310 mM) 20 ml sehingga menghasilkan konsentrasi akhir 1,5×109 spermatozoa / ml. Konsentrasi sperma diukur dengan haemocytometer Buker.

Semen selanjutnya didinginkan ke 5oC selama 2 jam dalam sentrifus. Pada suhu ini, semen perlahan-lahan dicampur dengan diluter ketiga yang terdiri dari 89,5 ml Ley extender, 9 ml 1,5 ml gliserol dan STM Equex dengan 2:1 antara semen dan diluter menghasilkan konsentrasi akhir gliserol 3%  1x 109 spermatozoa / ml pada 5oC. Konsentrasi sperma diukur dengan haemocytometer Buker.

Spermatozoa dikemas pada 5oC di kabinet dalam 0,5 ml straw (PVC) disegel dengan PVC bubuk dan ditempatkan pada rak untuk pembekuan. Rak dimasukkan ke dalam freezer MABLE pada suhu 5oC. Pembekuan dilakukan dengan program yaitu 3-5oC selama 5 menit. 1 menit untuk kristalisasi dan kemudian 5-140oC selama 50 menit. Barulah dimasukkan kedalam N2 cair (-196oC) untuk penyimpanan.

 

Desain eksperimental

Kinetik sperma, integritas membran plasma dan ekspresi GLUT-3 dan GLUT-5 dinilai pada tiga tahap yang spesifik:

A)      setelah diperpanjang di Beltsville thawing solution (BTS) dan terus didinginkan pada  17oC pada 24 jam

B)      setelah kembali diperpanjang diekstender-II (lactose–egg yolk (LEY)) dan didinginkan sampai 5oC selama 2 jam

C)      pasca-thawing.

Untuk setiap tahap pengolahan semen (A-C), alikuot spermatozoa diambil dan diperiksa kinetik sperma untuk menggunakan computer-assisted spermanalysis (CASA) dan untuk integritas membran menggunakan SYBR14/ethidium homodimer (EthD-1). Sampel dianalisis setelah 20 menit inkubasi pada 38oC. Dari alikuot masing sampel ditetapkan resuspensi 0,5% (b/v) paraformaldehyde, dan smear hasil immunocytochemistry dari GLUT-3 dan GLUT-5,  kemudian pemeriksaan mikroskop elektron. Akhirnya, sampel diambil untuk Elektroforesis SDS dan westren blotting GLUT-3 dan GLUT-5.

Integritas membran plasma sperma dan motilitas perma integritas membran plasma dapat ditunjukkan dari SYBR-14 dan EthD-1 fluorophores. Adapun prosedurnya yaitu semen sampel (0,5 ml) ditambahkan 2,7 ml dari 1 mM SYBR-14 solusi dimethylsulphoxide (suspensi A). 20 ml suspensi A dicampur dengan 20 ml larutan B yang mengandung 4 ml EthD-1 dalam 1 ml PBS (pH 7,2-7,4).

Spermatozoa diinkubasi pada 34-37oC selama 30 menit dalam ruang gelap sebelum persiapan dari smear basah untuk pengamatan mikroskop fluoresensi. Spermatozoa diklasifikasikan menjadi tiga kategori berdasarkan warna: hidup (hijau), mati (merah) atau rusak (warna ganda) dan minimal harus memiliki 200 sperma yang motil. 20μl sampel sperma ditempatkan dalam counting chamber Makler prewarmed (38oC) dan dianalisis dengan  alat CASA. Setiap sampel minimum memiliki 200 spermatozoa per sampel dan menghitung  persentase spermatozoa motil progresif kecepatan lurus dan linier.

Selanjutnya mempersiapkan sampel untuk dianalisis menggunakan Western blotting. Adapun caranya yaitu sampel sperma dicuci dua kali dengan PBS dan disentrifugasi dua kali pada 600rpm selama 10 menit. Pelet disuspensikan dan kemudian dihomogenkan dengan buffer mixer pada es-dingin sonication. Suspensi homogen direbus dan kemudian disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 15 menit pada 4oC. Supernatan dianalisis dengan western boltting. Kandungan total protein supernatan ini adalah dihitung dengan menggunakan metode Bradford (dengan kit). Kemudian dilakukan Immunocytochemistry and electron microscopy dan analisis statistik dengan MANOVA.

 

Hasil

Adapun kualitas sperma berdasarkan parameter fungsional sperma :

  1. Sperma integritas membran plasma. Persentase spermatozoa hidup setelah pencairan

(langkah C) secara signifikan lebih rendah pada Entrepelado daripada Lampino. Tidak ada perbedaan antara kedua breed pada langkah A dan B.

  1. Motilitas Sperma. Persentase motilitas kedua breed tidak menunjukkan perbedaan signifikan selama kriopreservasi antara Entrepelado dan Lampino. Perbandingan antara tiga tahapan proses kriopreservasi menunjukkan signifikan lebih rendah dari motilitas pasca-dicairkan air mani (langkah C) di kedua varietas, tetapi VSL tetap sama. Selain itu, persentase spermatozoa motil 0-30 menit pasca-thawing (stepC) sama, tetapi VSL secara signifikan lebih rendah setelah lebih dari 30menit pasca-thawing di kedua breed.
  2. Immunocytochemistry dari GLUT-3 dan GLUT-5. Analisis SEM dan TEM immunolabelling menunjukkan bahwa spermatozoa babi memiliki transporter heksosa (GLUT-3 dan GLUT-5) pada membran plasma luar dan dalam. Ekspresi dari transporter heksosa GLUT-3 isoform menunjukkan memiliki distribusi yang berbeda, baik dari segi lokasi dan konsentrasi antara spermatozoa pada semua prosedur (langkah A-C). Kekuatan immunoreactivity GLUT-3 diamati pada akrosom membran sperma pada 17oC (langkah A), padabagian anterior kepala terlihat batas equator. Dan bertahan hingga penyimpanan 5oC (langkah B) setelah menambahkan gliserol selama proses kriopreservasi pasca-thawing (langkah C), immunolabelling  kurang jelas baik terlihat intensitas dan distribusi transporter heksosa.

Immunolabelling isoform heksosa GLUT-5 pada 17oC (langkah A) terlihat berlokasi di apikal dan segmen wilayah acrosomal. Namun, immunoreactivity yang paling kuat terdeteksi sepanjang menghubungkan sepotong, bagian tengah dan bagian utama dari ekor sperma (Gambar 2). Sebaliknya GLUT-3 immunolabelling pola distribusinya dipertahankan pada 5oC (langkah B) dan pasca-thawing (langkah C).

Keberadaan transporter heksosa (GLUT-3 dan GLUT-5) dengan western blotting menunjukkan adanya pita spesifik sekitar 50 kDa selama pendinginan (langkah A dan B) dan pasca-thawing (langkah C). Intensitas band GLUT-3 spesifik pada supernatan dari sperma menurun pada semua prosedur (langkah A-C), sedangkan intensitas GLUT-5 meningkat selama langkah A-C.

 

Diskusi

Pendinginan sampai 5oC tampaknya tidak menjadi masalah, karena tidak ada perubahan signifikan yang terdeteksi baik di 17oC menjadi 5oC. Perubahan terjadi ketika pendinginan-pembekuan bawah 5oC. Pasca-thawing memberii efek pada akrosom sperma. Terjadi perubahan distribusi protein akibat dari relokasisasi transpoter heksosa 3 GLUT-dan GLUT-5 pada membran plasma spermatozoa. Semua protein ini terlokalisasi pada spesifik seluler kompartemen pada tingkat sperma kepala dan ekor untuk penyerapan glukosa dan fruktosa yang bertujuan menjaga metabolisme energi kedua transporter. Perubahan membran tersebut menurunkan kemampuannya sperma dalam menggunakan nutrisi energik sehingga motilitas menurun.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa sangat penting untuk masuknya substrat (dalam hal ini glukosa) ke dalam spermatozoa. Pada pasca-thawing berada ditengah dan bagian utama dari ekor. Distribusi GLUT-3 yang tidak merata pada sperma mempengaruhi metabolisme spermatozoa. Hal tersebut menunjukkan bahwa lokasi transporter heksosa spesifik yang tepat dapat memanfaatkan karbohidrat untuk mendapatkan energi.

Gangguan lipid terkait dengan pendinginan/ pembekuan / pencairan akan menyebabkan  perubahan dalam struktur membran caveolar sperma, yang mengubah lokasi dan keberadaan caveolae terkait membran protein seperti GLUT-3. Ekspresi GLUT-5 mengikuti pola yang berbeda, berpusat di wilayah pasca-acrosomal dan sepanjang bagian tengah dan bagian utama dari ekor dan tidak mengalami perubahan lokasi, distribusi atau intensitas meskipun spermatozoa rusak oleh proses kriopreservasi.

Perubahan struktural secara keseluruhan disebabkan oleh proses pendinginan atau pembekuan yang menyebabkan perubahan pada asosiasi GLUT-5 dengan non-larut struktur, dan hasilnya akan peningkatan kehadiran dari GLUT-5 dalam fraksi larut sperma. Di sisi lain GLUT-3 pada membran sel hanya akan hilang setelah pendinginan/pembekuan/pencairan, sehingga terjadi penurunan GLUT-3 dalam supernatan pasca-thawing.

Perubahan lokasi mempengaruhi kemampuan sperma babi untuk mengelola energi sehingga mengubah keseluruhan fungsi sperma setelah pencairan. Kesimpulan menegaskan penurunan kualitas sperma pada semen cryopreserved Iberia dan mengungkapkan bahwa suhu dibawah 5oC tampaknya menjadi faktor utama yang menjelaskan kegagalan sperma untuk bertahan hidup setelah proses pembekuan-pencairan. Selain itu, efek dari pendinginan-pembekuan suhu pada membran sperma babi hutan, kualitas gamet sperma itu sendiri.

 

 

BAB IV

PEMBAHASAN

Menurut hasil review jurnal berjudul Pengaruh  kriopreservasi pada kualitas semen dan ekspresi transporter heksosa membran sperma pada spermatozoa babi Iberia (Sancho et al, 2007). Pembuatan semen beku pada babi sebenarnya tidak efisien. Hal tersebut karena jumlah anak babi yang lahir dari inseminasi buatan hampir sama dengan perkawinan alami. Inseminasi buatan dinilai masih mahal walaupun lebih higiene.  Namun jurnal ini menitikberatkan fungsi pembuatan semen beku untuk melestarikan variabilitas genetik babi melalui program bioteknologi reproduksi.

Pada jurnal ini menggunakan metode kriopreservasi teknik baru yang memiliki prinsip dehidrasi sel pada suhu non-freezing (tidak beku). dan diikuti oleh pembekuan dan selanjutnya pencairan. Proses pembuatan semen seperti halnya pada semen sapi. Dari proses tersebut dibagi tiga yang menjadi fokus pengamatan kualitas semen. Langkah A semen ditambahkan BTS (Beltsville thawing solution) pada suhu 17oC selama 24 jam, kemudian langkah B ditambahkan ekstender-II atau diluter kedua yaitu lactose–egg yolk (LEY) dan didinginkan sampai 5oC selama 2 jam. Kemudian dimasukkan ke straw PVC disegel dengan PVC bubuk dan ditempatkan pada rak untuk pembekuan. Rak dimasukkan ke dalam freezer MABLE pada suhu 5oC. Pembekuan dilakukan dengan program yaitu 3-5oC selama 5 menit. 1 menit untuk kristalisasi dan kemudian 5-140oC selama 50 menit. Barulah dimasukkan kedalam N2 cair (-196oC) untuk penyimpanan. Langkah C pengujian dilakukan pasca-thawing.

Menurut jurnal tersebut tidak ada perubahan signifikan yang terdeteksi baik di 17oC menjadi 5oC. Perubahan terjadi ketika pendinginan-pembekuan dibawah 5oC. Pasca-thawing memberi efek pada akrosom sperma. Terjadi perubahan distribusi protein akibat dari relokasisasi transpoter heksosa 3 GLUT-dan GLUT-5 pada membran plasma spermatozoa. Semua protein ini terlokalisasi pada spesifik seluler kompartemen pada tingkat sperma kepala dan ekor untuk penyerapan glukosa dan fruktosa yang bertujuan menjaga metabolisme energi kedua transporter. Perubahan membran tersebut menurunkan kemampuannya sperma dalam menggunakan nutrisi energik sehingga motilitas menurun.

Pada pasca-thawing GLUT-3 berada ditengah dan bagian utama dari ekor. Distribusi GLUT-3 yang tidak merata pada sperma mempengaruhi metabolisme spermatozoa. Hal tersebut menunjukkan bahwa lokasi transporter heksosa spesifik yang tepat dapat memanfaatkan karbohidrat untuk mendapatkan energi.

Gangguan lipid terkait dengan pendinginan atau pembekuan atau pencairan akan menyebabkan  perubahan dalam struktur membran caveolar sperma, yang mengubah lokasi dan keberadaan caveolae terkait membran protein seperti GLUT-3. Ekspresi GLUT-5 mengikuti pola yang berbeda, berpusat di wilayah pasca-acrosomal dan sepanjang bagian tengah dan bagian utama dari ekor dan tidak mengalami perubahan lokasi, distribusi atau intensitas meskipun spermatozoa rusak oleh proses kriopreservasi.

Perubahan struktural secara keseluruhan disebabkan oleh proses pendinginan atau pembekuan yang menyebabkan perubahan pada asosiasi GLUT-5 dengan non-larut struktur, dan hasilnya akan peningkatan kehadiran dari GLUT-5 dalam fraksi larut sperma. Di sisi lain GLUT-3 pada membran sel hanya akan hilang setelah pendinginan atau pembekuan atau pencairan, sehingga terjadi penurunan GLUT-3 dalam supernatan pasca-thawing.

Perubahan lokasi mempengaruhi kemampuan sperma babi untuk mengelola energi sehingga mengubah keseluruhan fungsi sperma setelah pencairan. Kesimpulan menegaskan penurunan kualitas sperma pada semen cryopreserved Iberia dan mengungkapkan bahwa suhu dibawah 5oC tampaknya menjadi faktor utama yang menjelaskan kegagalan sperma untuk bertahan hidup setelah proses pembekuan-pencairan. Selain itu, efek dari pendinginan-pembekuan suhu pada membran sperma babi hutan, kualitas gamet sperma itu sendiri.

 

BAB V

PENUTUP

 

Pembuatan semen beku pada babi sebenarnya tidak efisien. Hal tersebut karena jumlah anak babi yang lahir dari inseminasi buatan hampir sama dengan perkawinan alami. Inseminasi buatan dinilai masih mahal walaupun lebih higiene.  Namun jurnal ini menitikberatkan fungsi pembuatan semen beku untuk melestarikan variabilitas genetik babi melalui program bioteknologi reproduksi. Dari jurnal tersebut diketahui bahwa proses pembuatan semen beku pada babi masih belum menemukan metode yang tepat karena perubahan letak transpoter heksosa sangat mempengaruhi motilitas dan viablitas dari sel sperma pada babi.

 

 

DAFTAR PUSTAKA

Bailey JL, Buhr MM. 1994. Cryopreservation alters the Ca2+ flux of bovine spermatozoa. Can J Anim Sci 74.

Ika Roostika Tambunan dan Ika Mariska. 2003.  Pemanfaatan Teknik Kriopreservasi dalam Penyimpanan Plasma Nutfah Tanaman. Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Bogor

Toelihere MR. 1985. Inseminasi Buatan pada Ternak. Bandung: Angkasa. Jones RC, Martin ICA. 1973. The effects of dilution egg yolk and cooling to 50

S Sancho, I Casas et all. Effects of cryopreservation on semen quality and the expression of sperm membrane hexose transporters in the spermatozoa of Iberian pigs. Reproduction (2007) 134 111–121

Suprianata, I. dan F.H. Pasaribu. 1992. In Vitro Fertization, Transfer Embrio dan Pembekuan Embrio. Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor.

Watson, P.F. 2000. The Causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim. Reprod.

Weitze, K.F. and R. Petzoldt. 1992. Preservation of semen. Anim. Repord.